کیت الایزا برای تشخیص بیماری بروسلوز در گوسفند

بروسلوز یک بیماری زئونوز است که علاوه بر انسان می تواند طیف وسیعی از دام ها و نیز حیوانات وحشی دیگر را درگیر کرده و با ایجاد سقط های خود به خودی در دام آلوده از طریق کاهش زادولد آنها خسارات هنگفتی به اقتصاد جامعه تحمیل می کند و به عنوان یک مشکل اساسی بهداشت جامعه می باشد .

روش ELISA جهت تعیین میزان تیتر آنتی بادی موجود در سرم­ گوسفند مورد استفاده قرار می گیرد.  این کیت به دلیل استفاده از پروتئین نوترکیب به جای باکتری از ویژگی های سلامت، سریع و قابل اعتماد بودن برخوردار بوده و قادر است آنتی بادی های علیه باکتری بروسلا در گوسفند را اندازه گیری کند.

اساس آزمون:

در این آزمون، پروتئين نوترکيب به عنوان آنتی ژن، همراه با بافر رقيق کننده به کف ميکروپليت­ها چسبانده شده که پس از طي دوره انکوباسيون، پليت ها توسط بافر شستشو شسته مي­شوند و در نتیجه آن عناصر غير باند با شستشو خارج مي گردند.

پس از اضافه کردن سرم و طي دوره انکوباسيون پليت ها مجددا شستشو و در مرحله بعد آنتي بادي کونژوگه با HRP اضافه مي شود. پس از اضافه کردن سوبستراي حاوي کروموژن و در نهايت افزودن محلول متوقف کننده، تيتر آنتي بادي توسط دستگاه  ELISA Reader با طول موج nm ۴۵۰ خوانده می شود.

اجزای کيت: 

                       اجزا

        تعداد ( حجم)

   پليت ۹۶ حفره اي الحاق شده با آنتی ژن

          ۱عدد

                   سرم کنترل مثبت

ml         ۵/۰

                   سرم کنترل منفي

ml         ۵/۰

                 بافر رقیق کننده سرم

ml          ۵۰

                  بافر شستشو ۲۰X

ml          ۲۵

                  کونژوگه(HRP)

ml         ۶/۰

             بافر رقیق کننده کونژوگه

ml           ۱۰

             معرف سوبسترا (TMB)

ml           ۱۰

    محلول متوقف کننده (Stop Solution) 

ml          ۱۰

یاد آوری:       

   تمام اجزای بالا باید در دماي °c۷-  ۲ نگهداري شوند.

 لوازم مورد نياز:

• ميکروتیوپ
• دستگاه Reader ELISA با طول موج nm ۴۵۰ 
• استوانه مدرج
•  سمپلر چند کاناله و تک کاناله با حجم هاي متفاوت 

  یاد آوری:

  پیش از استفاده ، تمام مواد مورد مصرف باید به دماي اتاق رسانده شوند.

نمونه گيري:

خون گيري و جداسازي سرم  و نگهداري در دماي اتاق براي ۴ روز و يا در دمای C°۲۰-  براي نگهداري طولاني مدت مطابق روش هاي معمول جمع آوري سرم است. سرم هاي مورد استفاده مي بايست به نسبت ۱۰۰/۱ در بافر رقيق کننده رقيق گردند. لازم به ذکر است که سرم هاي کنترل مثبت و منفي نياز به رقيق سازي ندارند.

   بافرهای رقيق کننده: بافرهای رقیق کننده موجود،آماده­ استفاده می باشند و نیاز به آماده­ سازی ندارند.         

  تهيه بافر شستشوي X ۱ :

پیش از استفاده، محلول X۲۰ را خوب تکان دهيد.

 جهت تهيه بافر شستشوي X۱،ml ۱ از بافر X ۲۰  شستشوي موجود درکيت را برداشته و با ml ۱۹ آب مقطر مخلوط كنيد.

توجه:تقريباً ml ۱۸۰  بافر شستشوی X۱ به ازاي هر ميکرو پليت مورد نياز است.

  کونژوگه:

 کونژوگه را به نسبت ۱۰/۱ (نسبت ۱میکرولیتر کونژوگهHRP  به ۹میکرولیتر بافر ) با بافر رقیق کننده کونژوگه رقیق نموده و ظرف مدت چند ساعت مصرف گردد.

 تهيه محلول سوبسترا:

این محلول آماده استفاده می باشد .(به ازاي هر ميکروپليت ml۵ مورد نیاز است.)

محلول متوقف کننده :

 این محلول آماده استفاده می باشد .(به ازاي هر ميکروپليت ml۵ مورد نیاز است.)

 روش انجام آزمون الايزا:

  مرحله اول:

۱.  ميکروپليت الحاق شده با آنتی ژن را از پوشش خارج کنيد.

۲.  سرم ها را به نسبت ۱۰۰/۱ با محلول رقيق کننده بصورت مجزا رقيق سازيد . لازم به ذکر است سرم های کنترل مثبت و منفی نیاز به رقیق سازی ندارند.

۳.  µl ۵۰ از سرم هاي رقيق شده، همچنين µl ۵۰ از سرم هاي کنترل مثبت­ و منفي را به حفره هاي میکروپلیت اضافه کنيد.

۴.  پس از درپوش گذاشتن روی پلیت به مدت ۳۰ دقیقه در دماي اتاق انکوبه کنيد.

مرحله دوم: (شستشو)

۱. محتويات حفره ها را کاملاً خالي نمائيد.

۲.  µl۳۰۰ از محلول شستشو را به هر حفره اضافه و به مدت ۱-۲ دقيقه به صورت ملایم به پلیت ضربه بزنید.

۳. مرحله ۲ را سه بار تکرار کنيد.

۴. حفره ها را کاملا ًخالي نمایید و با اعمال ضربه های متوالی بر روی پارچه و یا کاغذ آن ها را هرچه بیشتر خشک نمایید.

مرحله سوم:  (اضافه کردن کونژوگه، سوبسترا و محلول متوقف  کننده)

۱.  µl ۵۰ از محلول کونژوگه به هر حفره اضافه کرده و پس از درپوش گذاشتن

روی پلیت به مدت ۳۰ دقیقه در دماي اتاق انکوبه کنيد.

۲.  سه مرتبه پليت را خالي و شستشو کنيد.( مطابق مرحله دوم)

۳. µl ۵۰ از محلول سوبسترا به هر حفره اضافه کنيد و به مدت ۱۰ دقيقه در دماي اتاق و به دور از نور مستقیم انکوبه کنيد.

۴.  µl ۵۰ از محلول متوقف کننده به هر حفره اضافه و به صورت ملایم به پلیت ضربه بزنید. *(قبل از خوانش پلیت ، کف حفره ها را با پنبه تمیز پاک نمایید؛ به طوریکه پرز به کف چاهک ها نچسبد.)

۵. ميزان جذب را با طول موج nm ۴۵۰ اندازه گيري کنيد.

یادآوری : جهت استفاده  بقیه چاهکها؛ پس از اتمام کار پلیت را خالی کرده و با اعمال ضربه های متوالی بر روی پارچه یا کاغذ پلیت را کاملا خشک نمایید ، سپس پلیت را همراه با دسی کانت (رطوبت گیر) موجود در کیت ، داخل پوشش زیپ دار گذاشته و در یخچال قرار دهید.  

نتایج:

برای اعتبار دهی به نتایج آزمون، میانگین جذب نوری کنترل منفی باید کمتر از ۱۸/۰و تفاضل میانگین کنترل منفی و کنترل مثبت بزرگتر از ۱۵/۰ باشد.

یادآوری:

عدم ثبات دمای آزمایشگاه منجر به مقادیر بالاتر یا پایین تر جذب نوری خواهد شد. مقادیر نمونه مورد آزمون نسبت به مقدار کنترل ها (مثبت و منفی) سنجیده شده و نتایج آزمون به این نحو اعتبار دهی خواهند شد.

کنترل مثبت به نحوی استاندارد شده که نمایانگر مقدار شاخص آنتی­بادی بروسلا در سرم گاو باشد. بنابراین مقادیر نسبی آنتی بادی ها در نمونه های سرم می تواند با ارجاع به مقادیر کنترل مثبت محاسبه شود. این ارتباط تحت عنوان نسبت S/P بیان­ می شود.